Деринат защищает кожу от ультрафиолет (УФ-В) индуцированного повреждения клеток.

02.11.2016

1 Институт фундаментальных медицинских наук, медицинский колледж, National Cheng Kung University, 1 University Road, Тайнань 70101, Тайвань

2 Научно-исследовательский центр изучения липидов и старения, Медицинский университет Гаосюн, Гаосюн 80708, Тайвань

3 Высший институт медицины, медицинский факультет, медицинского университета Гаосюн, № 100, Shih-Chuan первый Road, Гаосюн 80708, Тайвань

4 Лаборатория патофизиологии, Высшая школа фармацевтических наук, Университет Кюсю, 3-1-1 Maidashi, Хигаси-ку, Фукуока 812-8581, Япония

5 Отделение дерматологии, медицинского университета Гаосюн, № 100, Ши-цюань 1 Road, Гаосюн 80708, Тайвань

6 Школа Высоких Технологий благополучия человека, Университета Токай, 410-0321 Numazu, Сидзуока, Япония

7 Научно-исследовательский институт Национального здравоохранения, Национальный научно-исследовательский центр гигиены окружающей среды, № 35, Keyan Road, Zhunan Town, Miaoli County 35053, Тайвань

8 Школа фармации, медицинского университета Гаосюн, Гаосюн 80708, Тайвань

9 Центр исследований стволовых клеток медицинского университета, Гаосюн 80708, Тайвань

10 Отдел физиологии, медицинский колледж, National Cheng Kung University, 1 Университет Роуд, Тайнань 70101, Тайвань

Абстракт.

 Ультрафиолет-B (UVB) является одним из наиболее цитотоксических и мутагенных излучений, вызывающих повреждение кожи и старение путем повышения содержания внутриклеточного Ca 2+ и активных форм кислорода (АФК). Деринат (дезоксирибонуклеат натрия) был использован в качестве иммуномодулятора для лечения заболеваний индуцированных АФК  в клинике. Молекулярный механизм с помощью которого Деринат защищает клетки кожи от УФ -индуцированного повреждения мало изучен. Здесь мы покажем, что Деринат значительно ослабляет UVB-индуцированную продукцию внутриклеточного АФК и уменьшает повреждения ДНК в собственных клетках кожи. Кроме того, Деринат снижает содержание внутриклеточных АФК, активацию циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) и повреждение ДНК в коже мышей линии BALB / C-Nu, подвергнутых воздействию UVB в течение семи дней.  Важно отметить, что Деринат блокирует классических потенциал зависимых кальциевых каналов  класса «С», «канонических»\ (TRPCs), что было показано с помощью  визуализации потока кальция. Таким образом наши результаты показывают, что Деринат действует как блокатор TRPCs , уменьшающий внутриклеточный образование внутриклеточных АФК и повреждение ДНК при УФ -облучении. Этот механизм обеспечивает потенциальное новое применение Деринат для защиты от УФ - индуцированного повреждения кожи и старения.

Ключевые слова: Деринат; УФО; АФК; кальций; TRPCs.

1. Введение

Ультрафиолетовое излучение (УФО) является основным этиологическим фактором старения кожи и связанных с ним заболеваний и симптомов, таких как морщины, эпидермальная гиперпигментация, повышенный синтез меланина и раковые заболевания [ 1 ]. Среди трех видов УФО в солнечном свете, ультрафиолетовое-В (УФ-В), излучение 280-320 нм) является наиболее цитотоксическими и мутагенными электромагнитными волнами, а также способствуют повреждению кожи и старению [ 2 , 3 ]. Так как энергия УФ-B достаточна для создания активных форм кислорода (АФК) в живой ткани, она приводит к нарушению ДНК и онкогенезу в коже, связанному с внутриклеточным повышением  Са 2+  [ 4 , 5 ]. Эти факты были установлены независимо друг от друга. В настоящее время молекулярные и клеточные связи между увеличением АФК и внутриклеточного Ca 2+  в живых клетках недостаточно хорошо изучены. Хотя было разработано большое количество соединений и препаратов, чтобы исследовать механизм УФ-B - индуцированного повреждения кожи за счет повышения АФК и Ca 2+  [ 6 , 7 , 8 , 9 ], приемлемые модели для объяснения отношений между УФ-B, потока в клетку Ca 2+ , повреждения ДНК и клеток отсутствуют, поскольку модели внутриклеточного влияния  АФК изучаются  в различных областях биохимии и физиологии. Из-за разрыва между экспериментальными результатами исследований in vitro и in vivo, которые не позволяют проводить прямые сравнения, трудно объяснить токсическое действие УФ-B на кожу с помощью этих разных моделей. Кроме того были предприняты попытки применения нескольких типов веществ подавляющих УФ повреждение: путём непосредственного добавлением к среде in vitro и косвенного воздействия на клетки (внутрисосудистой инъекции) in vivo . Таким образом, чтобы примирить фундаментальные различия между экспериментальными результатами in vivo и in vitro , мы попытались определить подходящий препарат для изучения молекулярного механизма, с помощью которого УФ-B индуцирует повреждение кожи и старения.

Деринат (дезоксирибонуклеат натрия), является популярным клиническим препаратом с многолетней историей и опытом использования в России. Он содержит натриевую соль ДНК, выделенной из молок Acipenser gueldenstaedtii (осетровых рыб), который деполимеризуется в 0,1% растворе хлорида натрия до частиц с молекулярной массой 270-500 кД с использованием ультразвука[ 10 ].Клинические исследования показали, что Деринат имеет уникальные иммуномодулирующие свойства, которые применяются для патогенетического лечения, сепсиса, воспалительных состояний и язв. [ 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ,16 ]. Например, в исследовании по терапии ревматоидного артрита, Деринатом было обнаружено, что он подавляет фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа) и ускоряет бласттрансформацию лимфоцитов у крыс [ 17 ].Деринат также использовался в качестве терапевтического средства в клинике при терапии различных инфекций, воспалительных состояний и язв, которые коррелируют с повышением синтеза АФК[ 18 , 19 , 20 ]. Тем не менее, большинство молекулярных механизмов, с помощью которых функционирует Деринат, остаются неясными. Таким образом, Деринат будет хорошим препаратом, чтобы понять механизм УФ-B - индуцированного клеточного повреждения in vivo и in vitro .

Мы предположили, что Деринат защищает кожу от УФ - индуцированного повреждения путем ингибирования внутриклеточного повышения Ca 2+ , в свою очередь вызванного блокадой каналов суперсемейства TRP (transient receptor potential channels). Наше исследование выявило основные механизмы, с помощью которых Деринат защищает кожу от УФ - индуцированного разрушения кожи в пробирке и in vivo. С этой целью мы использовали кератиноциты (КЦ) и кожные фибробласты (КФ) крайней плоти человека, а затем исследовали УФ-B-индуцированные повреждения этих клеток кожи в пробирке. Кроме того, для  исследований in vivo, мы изучили УФ-B-индуцированные симптомы повреждения кожи у голых мышей. Наши результаты показали, что Деринат существенно защищает не только клетки кожи, но и эпидермис голых мышей от УФ-B-индуцированного повреждения. Суммарно, эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат уменьшает старение кожи путем угнетения внутриклеточного повышения концентрации Ca 2+ и может быть полезен для профилактики и лечения возрастных заболеваний, ассоциированных с этими симптомами.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Деринат защищает клетки кожи от повреждений, вызванных УФ облучением.

Для изучения влияния Дерината на УФ-В - индуцированное повреждение кожи, мы сначала определили эффективную дозу препарата в клетках кожиin vivo с использованием человеческих кератиноцитов (КЦ) и кожных фибробластов (КФ).Клетки кожи облучали различными дозами УФ-B, а затем определяли жизнеспособность клеток количественно, для различных доз радиации, как описано в экспериментальном разделе.Рисунок 1 Пункты A и B показывают ,что 45% КЦ и 65% КФ выжили после воздействия УФ-B интенсивностью50 мДж / см2и 100 мДж / см2, соответственно.Клетки  предварительно обрабатывали  различными концентрациями Дерината споследующим кондиционированием  втечение 24 ч. Использовали 15 мкг / мл Дерината для КЦ (рис 1С) и 150 мкг / мл Деринат для КФ, а затем облучали УФ –B.Такой подход эффективно предотвращал  УФ-B-индуцированное повреждение в клетках кожи (Рисунок 1D).Никаких дополнительных токсических эффектов не наблюдалось в ответ на обработку клеток Деринатом. (Рисунок 1C, D).Выживаемость КЦ и КФ была 70% и 78% соответственно (Рисунок 1E, F). Эти результаты показали,что Деринат способствует выживаемости кератоцитов и кожных фибробластов в ответ на УФВ-индуцированное повреждение.


Рисунок 1.

Рисунок 1. Деринат защищает клетки кожи от повреждения УФ-B. Эффект УФ-В облучения на жизнеспособность клеток в ( А ) кератиноцитов (КЦ) и ( Б ) фибробласты кожи человека (КФ) ( *** ,р <0,001). Вероятность выживания клеток для клеток , предварительно обработанных различными концентрациями Деринат в течение 24 ч облучённых  или без УФ-В-облучения в ( C ) KЦ и ( D ) КФ ( * , р <0,05;*** , р <0,001). Далее для подтверждения результата (C , D ), в ( Е ) KЦ и ( F ) КФ  предварительно обрабатывают с помощью 15 мкг и 150 мкг Деринат и облучали Е=50 мДж / см 2 и Е=100 мДж / см 2, соответственно. Вероятность выживания клеток анализировали с помощью МТТ через 24 ч UVB-облучения ( * , р <0,05; *** , р <0,001). (MTT-тест – это колориметрический тест  для оценки метаболической активности клеток.  НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток.)

  2.2. Деринат сокращает повышение концентрации внутриклеточного Са 2+ в клетках кожи, подвергнутых УФО.

Предыдущие исследования показали, что УФ-B - излучение увеличило внутриклеточную концентрацию Ca 2+  и вызывало  повреждение и старение кожи [ 21 , 22 ]. Поэтому мы предположили, что Деринат защищает клетки кожи от УФ -B - индуцированного повреждения, блокируя повышение  внутриклеточного Ca 2+. Чтобы проверить эту гипотезу,  мы измерили концентрацию  внутриклеточного Ca 2+  с помощью Fluo-4 окрашивания.  Клетки кожи подвергались УФ - облучению после предварительной обработки  Деринатом в течение 24 ч. Через 30 мин УФВ облучения концентрация  внутриклеточного Са 2+  измерялась с использованием флуоресцентного микроскопа Olympus со средней интенсивностью флуоресценции клеток  более 150. Экспериментальный протокол для каждой группы представлена ​​на рисунке 2 А, а калибровочная кривая  Са 2+ была сгенерирована из расчёта его внутриклеточной концентрации в клетках кожи под микроскопом ( рис 2 B). Рисунки 2 C, D показывают , что Деринат почти полностью блокировал УФ-В-индуцированное внутриклеточное повышение Ca 2+  в КЦ, в то время как он показал меньшую , но статистически значимую блокаду  Ca 2+  в УФ-B обработанных КФ. Эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат блокирует УФ-B-индуцированное повышение Ca 2+ в обоих типах клеток КЦ и КФ. Мы также проверили состояние  клеточного окружения на предмет увеличения УФ-B-индуцированного  повышения концентрации  Са 2+ . Применение этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), образующей хелатный комплекс с  внеклеточным Са 2+ , показывает снижение концентрации  внутриклеточного Са 2+  в зависимости от дозы Дерината в клетках кожи через 30 мин после  УФ-В облучения ( рис 2 C, D).  Результаты показывают,  что Деринат снижает УФ-В-индуцированный ток ионов Са 2+  из внеклеточного пространства во внутриклеточное пространство. Интересно, что Деринат также блокирует повышение концентрации Ca 2+  в клетках кожи через 24 ч после облучения УФ-B ( Рисунок 2 E, F). Возможно,  Деринат блокирует некий начальный триггер для УФ-B-индуцированного  повышения Ca 2+  в клетках кожи.


Рисунок 2. Влияние Дерината на концентрацию внутриклеточного Са 2+  в клетках кожи подвергшихся  УФ-B воздействию.  Экспериментальный дизайн для обработки каждой группы: контрольная группа, УФ-B, ЭДТА, УФ-В + Деринат, и только Деринат; ( B ): калибровочная кривая концентрации  Ca 2+ ; ( С , D ): среднее  значение  внутриклеточного Са 2+, УФ-В-воздействию, УФ-В облучение + экспонирование с  различными концентрациями ЭДТА,УФ-B-облучения с Деринатом  и только Деринатом  в KЦ и КФ культивировали  в BSS ( balanced salt solution - cбалансированный солевой раствор )  в течение 30 мин (* , р <0,05; *** , р <0,001); ( Е ) КЦ и ( F ) КФ были предварительно обработаны с использованием или без использования  Дерината в течение 24 ч и затем их подвергали воздействию УФ – B излучения. Концентрацию  внутриклеточного Ca 2+  затем измеряли через 24 ч инкубации в нормальной среде ( *** , р <0,001).

Для того, чтобы исследовать механизм, с помощью которого Деринат блокирует ток ионов Ca 2+, клетки кожи были предварительно обработаны  Деринатом в течение 30 мин, и  затем был проведён  анализ изображений. Сначала мы использовали тапсигаргин (ТГ) для повышения уровня цитозольного Ca 2+ путём истощения депо Ca 2+. Как показано на рисунке 3 A и B, УФ-B облучение не влияет на ТГ-активированный Ca 2+ ток в клетках кожи. Далее мы определили,  влияет ли УФ-В облучение на способность  катионных каналов суперсемейства TRP  изменять ток Са2+?  Так например ,диацилглицеринацилтрансфераза (DAG) активизирует большинство  каналов суперсемейства TRP [ 23 , 24 ], и ультрафиолетовое (УФ) облучение увеличивает концентрацию  DAG [ 25 ], в предыдущих исследованиях была  выдвинута гипотеза , что TRP каналы могут способствовать УФ-B-индуцированному повышению  внутриклеточного Ca 2+  в коже [ 23 ]. Впоследствии обнаружилось , что оно  предшествует повышению уровня катионов Ca 2+.  Как показано на рисунке 3 (С, D) Деринат,  борат 2-аминоэтоксидифенила  (2-АПБ)  (представляет собой химическое вещество , лабораторный  ингибитор каналов суперсемейства TRP в малых дозах, но стимулятор классов  TRPV1, TRPV2, TRPV3 этого семейства в больших дозах.) и SKF96365 (Блокатор каналов суперсемейства TRP. Угнетает объёмный входящий ток  Ca 2+)[ 26 , 27 ] значительно уменьшают зависимое  от DAG аналога 1-олеоил-2-ацетил- SN-глицерина (ОАГ) (Проницаемый аналог PKC- и zeta активирующего второй  внутриклеточный месседжер  DAG. Например,  PKC 412 угнетает рост или индуцирует апоптоз во многих типах раковых клеток, блокирует ангиогенез в опухоли, и сенсибилизирует раковые клетки к ионизирующей радиации, поддерживая его применение в терапии рака.), повышение  проницаемости  мембраны для  Са 2+ в КЦ и КФ после 30 минут облучения  УФ-B.  Медикаментозный пик  внутриклеточного тока Са 2+  был заблокирован Деринатом  при облучении  в диапазоне от 970 нм до 800 нм для кератоцитов (рис 3 E) и от 1300 до 1100 нм для кожных фибробластов (рис 3 F), соответственно. Согласно исследованию Венкатачалам, опубликованном в 2007 году, каналы суперсемейства TRP, классы: TRPV1 и TRPA1 активируются DAG [ 24 ]. Тем не менее, на Рисунке 3 C-F показано, что классы TRPV1 и TRPA1 этого суперсемейства  не участвуют в УФ-B индуцированном повышении уровня  Ca 2+  что доказывается отсутствием повышения Са 2+ при контрольной экспозиции клеток  с боратом 2-аминоэтоксидифенила  (2-АПБ) [ 28 , 29 ]. В то время как Деринат и ингибиторы эффективно блокировали каналы суперсемейства TRP  при их активации с помощью  диацилглицеринацилтрансферазы (DAG)  после 30 мин облучения  УФ-B, мы подтвердили , что они могут быть вновь активированы УФ-В. Аденозинтрифосфат (АТФ) был применен в качестве стимулятора, чтобы вызвать реакцию каналов TRP, так как АТФ активирует фосфолипаза-C зависимый путь сигнализации , который вызывает открытие TRPCs [ 30 , 31 , 32 ,33 ]. Мы в первую очередь проверили эффект АТФ на Ca 2+ реакцию в клетках кожи. Облучение УФ-B слегка повышало уровень АТФ активированного Ca 2+, который снижался после  обработки  Деринатом, SKF96365 и 2-АПБ (рисунок 3 G-J). Таким образом подтверждается  активация  каналов TRPCs по фосфолипаза-C -зависимому пути передачи сигнала. Как показано на рисунке 3 K-N, Деринат и лабораторные  ингибиторы сдерживают УФ-B-индуцированное увеличение тока Ca 2+  путем стимуляции фосфолипазы - C  в клетках кожи..   На основании наших результатов  мы  можем исключить участие  TRPM5 и TRPM7 (TRPM – «Меластатиновое» ('Melastatin') семейство суперсемейства TRP.) в фосфолипаза-C -зависимом пути  увеличения тока  Ca 2+. Например, каналы класса TRPM5 в коже присутствуют в очень небольшом количестве [ 34 ]; А класс каналов TRPM7 не может быть активирован с помощью диацилглицеринацилтрансферазы DAG. Поэтому селективная блокада каналов суперсемейства TRP указывает что Деринат уменьшает УФ-B-активированное  повышение Са2+ на начальной стадии.  Интересно, что через 24 ч УФ-B облучения, каналы классов TRPC1, TRPC4, TRPC6 и TRPC7, которые начинают экспрессироваться  в клетках кожи  [ 34 ], также блокируются Деринатом и 2-AПБ, особенно каналы класса TRPC7 ( Рисунок 4 А, В). Исходя из своих физико - химических особенностей Дерината и  каналов TRPCs, первый  может блокировать активность каналов аналогичным образом, как тетродотоксин (ТТХ) блокирует натриевые каналы [ 35 ]. Тем не менее, в отличие от ТТХ, Деринат отрицательно заряжен, и, поэтому, не может заблокировать каналы. Кроме того, гетерогенная смесь ДНК уменьшает альтерацию, так как местно нанесённый  раствор поглощает УФ-B излучение, предотвращая повреждение клеток. За исключением случаев  УФ-B-индуцированной активации  каналов TRPCs, Деринат содержит гетерогенную ДНК которая может защитить клетки кожи от повреждения  с помощью поглощения света в диапазоне УФ-B.


Рисунок 3. Деринат снижает УФ-B активированные Ca 2+ сигналы в клетках кожи. Са2+ визуализация   тапсигаргин (TG)- индуцированной  Ca 2+ реакции после применения 20 нМ TG (маленькие черные полосы) в  кератоцитах (А) и 100 нМ TG в кожных фибробластах (В)  ( п = 3). Через 30 мин после предварительной обработки  Деринатом (D), SKF96365 ( 20 мкМ для КЦ и 50 мкМ для КФ), боратом 2-аминоэтоксидифенила (2-АПБ, 50 мкМ для КЦ и 100 мкМ для КФ), SKF96365 + Деринат; 1-олеоил-2-ацетил- SN-глицерин (ОАГ) при 100 мкМ и 200 мкМ вносили в пробирку с КЦ  ( C )  и  КФ (D), соответственно, для стимуляции  Ca 2+ реакции каналов TRPCs через 30 минут лучевого воздействия  ( п = 3). ( E , F ) количественное определение пика внутриклеточных Ca 2+ реакций, показанных на ( C ) и (D ) (*, р <0,05; **, р <0,01; ***, р <0,001). Са2+ визуализация анализа  аденозинтрифосфат (АТФ)- индуцированной Ca 2+ реакции. Применение 100 мкМ АТФ (небольшие черные полосы) для КЦ  ( G ) и 200 мкМ АТФ для КФ (H ) ( п = 3). ( I, J ), количественное определение пика внутриклеточных Ca 2+ реакций , показанных в ( G , H ) (*, р <0,05; ***, р<0,001). CaCl 2 был применен внеклеточно (большой черный столбик) для увеличения Ca 2+ от 0 до 2 мм и открытия каналов TRPCs после применения АТФ (небольшие черные полосы) в кератоцитах ( K ) и в кожных фибробластах ( L ) в  растворе  BSS (условно физ.раствор.)  свободном от Ca 2+ (неокрашенный столбик) ( п = 3). ( M , N ) Количественное изображение пика внутриклеточных Ca 2+ реакций , показанных в ( K , L ) после применения CaCl 2 (*, р <0,05; **, р <0,01; ***, р <0,001). Ca 2+ сигналы представлены  средним значением, полученным от 20 клеток.


Рисунок 4. Деринат значительно ингибирует УФ-B-индуцированное увеличение экспрессии Са2+ каналов класса TRPC7 в клетках кожи. Клетки подвергали воздействию УФ - облучения после обработки Деринатом и 2-АПБ в течение 30 мин. После облучения ,в течение 24 ч измеряли экспрессию каналов TRPC1, TRPC4, TRPC6 и TRPC7  по содержанию  в растворе экстрактов  м-РНК, обнаруженных от общего количества экстрактов РНК ( А ) в пробирке с кератоцитами и ( B ) в пробирке с кожными фибробластами, измеряли с помощью ОТ- модификации ПЦР (*, р <0,05 ; **, р <0,01; ***, р <0,001).

Обобщённо, эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат действует как блокатор каналов TRPCs уменьшая содержание внутриклеточного Ca 2+ . В будущем важно  определить  вклад каждого класса каналов суперсемейства  TRPCs участвующего в регуляции УФ-В активированного повышения уровня Ca 2+ с использованием si-РНК  (малые, интерферирующие РНК, класс 2-х цепочечных РНК).

2.3. Деринат снижает оксидативный  стресс  после УФ-В  облучения клеток кожи.

Первым ответом на увеличение УФ-B-индуцированных  активных форм кислорода (АФК) в клетках кожи является повышение внутриклеточного Ca 2+ [ 21 ]. На основании полученных данных  Деринат уменьшал УФ-B-индуцированное повышение Ca 2+ . Эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат защищает клетки кожи от УФ – В индуцированного повреждения. Это происходит за счет снижения уровня Са 2+ стимулированной  внутриклеточной продукции АФК митохондриями. Мы проверили эту гипотезу, выполнив следующий эксперимент: тридцать минут после воздействия УФ-B, уровень внутриклеточных АФК слегка увеличился на 1,25 раза в КЦ ( Рисунок 5 A, C). Предварительная обработка  Деринатом  или N - ацетилцистеином ​​(НАЦ), который по некоторым сообщениям является  внутриклеточным  поглотителем АФК ,  ингибирует УФ-B-индуцированное внутриклеточный синтез АФК и повреждение ДНК в клетках кожи [ 36 ]. Инкубация клеток с ЭДТА после воздействия УФ-B даёт аналогичные результаты. Интересно отметить , что эффекты Дерината и НАЦ на кожные фибробласты не отличались после 30 мин воздействия УФ-B ( рис 5 В, D). Тем не менее, как КЦ так и КФ показали снижение уровня внутриклеточной генерации активных форм кислорода через 24 ч после обработки Деринат и НАЦ при воздействии УФ-B  (Рисунок 5 E, F). Измеренные объемы синтеза внутриклеточных АФК в КЦ и КФ показали , что Деринат снижает их уровень  УФ-B-индуцированной продукции  с 2.25- до 1,67 раза и с 2.52- до 1,53 раза для кератоцитов  и кожных фибробластов, соответственно ( рис 5 G ,H ). Аналогичные результаты были получены в группе предварительной обработки НАЦ ( Рисунок 5  G, H). Эти результаты четко показывают, что Деринат подавляет УФ-В-индуцированный внутриклеточный синтез АФК за счет блокады внутриклеточного Са 2+  в клетках кожи.

 2.4. Деринат защищает клетки кожи от УФ-В-индуцированного повреждения ДНК.

УФВ-индуцированная генерация  внутриклеточных АФК через оксидазный путь утилизации,  способствует повреждению ядерной и митохондриальной ДНК. Оба процесса  наблюдаются  при накоплении 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (8-oxodG) в клетках кожи [ 37 , 38 ]. Как было показано в наших результатах исследований  выше, Деринат может защитить клетки кожи от УФ-B-индуцированного повреждения ДНК за счет снижения уровня внутриклеточного продукции АФК. Мы следующим образом  исследовали влияние Деринат на УФ-B-индуцированные повреждения ДНК. Клетки кожи были предварительно экспонированы с  Деринатом или НАЦ в течение 24 ч, Затем измеряли  соотношение повреждения ДНК и уровня 8-oxodG через 24 часа после облучения УФ-В. Предварительная обработка  кератоцитов Деринатом и НАЦ уменьшило отношение повреждения ДНК с 51% до 12% и от 51% до 23% соответственно ( рис 6 А, В). Аналогичные результаты наблюдались также в кожных фибробластах, но Деринат и НАЦ после предварительной обработки снижает соотношение количества повреждений ДНК до 2% и 3%, соответственно (рис 6 C, D). Эти результаты подтверждают наши выводы выше для клеток кожи: Деринат защищает их от УФ-B-индуцированной альтерации за счет подавления роста внутриклеточного Ca 2+, подавления генерации активных форм кислорода и повреждений ДНК, препятствуя ухудшению кожи и уменьшая потенциал старения.


Рисунок 5. Влияние Деринат на УФ-B индуцированный  внутриклеточный синтез АФК в клетках кожи. ( А) кератоциты и ( Б ) кожные фибробласты были предварительно обработаны  Деринатом и 0,5 мМ раствором НАЦ в течение 24 ч , а затем облучены УФ-B. ЭДТА (1 мМ) наносили после облучения УФВ. Уровень АФК измеряли через 30 мин УФ-В облучения с использованием 5 мкМ dihydroethidium (ДНЕ) окрашивания. Уровень продукции внутриклеточного АФК со средней интенсивностью флуоресценции более 150 клеток   ( А ) и ( В ) количественно для КЦ ( C ) и КФ ( D ) (***, р<0,001; *, р <0,01) , Для дальнейшего исследования внутриклеточной генерации активных форм кислорода в КЦ ( Е ) и КФ ( F ), клетки культивировали в нормальной среде в течение 24 ч после УФВ-облучения. Внутриклеточная продукция АФК была зафиксирована с помощью конфокального микроскопа с использованием ДНЕ окрашивания. Количественное определение внутриклеточной продукции активных форм кислорода из ( E , F ) показано в ( G , H ) (***, р <0,001).


Рисунок 6. Влияние Дерината на УФВ-индуцированное повреждение ДНК в клетках кожи. Был измерен 8-oxodG, чтобы зафиксировать повреждение ДНК в результате УФВ-облучения в клетках, предварительно обработанных  Деринатом и НАЦ: (А) кератоциты  и кожные фибробласты ( С ). Относительные величины повреждения ДНК по отношению к  8-oxodG количественно  ( B , D ) (**, р<0,01; ***, р <0,001). Приведенные данные  представляют собой среднее измерение из трех независимых экспериментов.

2.5. Деринат защищает мышей линии BALB / C-nu от УФB-индуцированных повреждений кожи.

Далее мы исследовали, защищает ли Деринат кожу мышей линии BALB / C-nu от УФB-индуцированного повреждения в путем наблюдения за десквамацией, толщины эпидермиса, синтеза АФК и повреждения ДНК. Деринат относится к водорастворимым агентам, поэтому его не легко вводить кожу. Мы сотрудничали с компанией SOMAPEX Biotech & Co(Гаосюн, Тайвань) с целью разработки специального гидрогеля Деринат (D-гидрогеля).  Деринат гидрогель помогает ткани кожи поглощать препарат, обеспечивая равномерное распределение дозы на поверхности кожи [ 39 , 40 ]. Деринат-содержащий гидрогель нанесли на круговые чипы 3-см в диаметре. Три различные концентрации Дерината в гидрогеле были подготовлены к эксперименту в естественных условиях:  0 (контроль), 3,5 мкг / см ²(15 мкг / мл) и 14 мкг / см² (60 мкг / мл). В ходе эксперимента мышей линии BALB / C-nu механически иммобилизовали. Кожа каждой мыши была покрыта различными концентрациями Деринат гидрогеля в течение 3 ч. Через 3 часа после обработки, мышей линии BALB / C-nu облучали УФ-В с Е= 360 мДж / см²  [ 6 ]. Через семь дней это излучение привело к серьезному шелушению и эритемы на коже спины в мышей линии BALB / C-nu, как показано на рисунке 7 A, в то время как 3,5 мкг / см²  и 14 мкг / см² Дерината гидрогеля смягчали этот УФВ-индуцированное повреждения кожи животного. Кроме того, область кожи брюха каждой мыши использовали в качестве контроля, и никакого эффекта от облучения в этой области не наблюдалось. Лечение Деринатом блокировало уменьшение толщины эпидермиса и внутриклеточную продукцию АФК, индуцированную УФ-B (рис 7 B, C).  Концентрация  внутриклеточного Са 2+  может  регулироваться циклооксигеназой-2 (ЦОГ-2), от которой, как известно, зависит УФ-B индуцированное воспаления [ 41 , 42 ]. Синтез ЦОГ-2 также, как ожидается, увеличится в ответ на УФ - облучении эпидермиса мыши [ 41 ]. Таким образом, мы тестировали, влияет ли Деринат на экспрессию ЦОГ-2 в клетках кожи? Как показано на фиг.7 , B, D, лечение Деринатом снижало экспрессию ЦОГ-2. УФ-В-индуцированная экспрессия TRPC7 также снизилась под влиянием Дерината (рис 7 Е). Деринат защищает клетки кожи от УФ-B-индуцированных повреждений ДНК мышей линии BALB / C-nu,  (рис 7 B). Для дальнейшего объяснения защитного эффекта Дерината повреждения ДНК   клеток кожи, мы взяли биопсию кожи, а затем экстрагируют геномную ДНК из нее , чтобы количественно определить процент повреждения ДНК с использованием набора II  HT 8-oxodG ELISA( Trevigen Inc., Gaithersburg, штат Мэриленд, США). Количественный анализ 8-oxodG отображённый на рисунке 7 , F, демонстрирует, что Деринат подавляет УФВ-индуцированное повреждения ДНК в зависимости от дозы. Результаты эксперимента in vivo показали , что Деринат эффективно уменьшает УФВ-индуцированное негативное воздействие на кожу такое как: шелушение, эпидермальную пролиферацию, внутриклеточную продукцию активных форм кислорода, повреждение ДНК и экспрессию ЦОГ-2 у мышей линии BALB / C-nu. Интересно отметить, что реакция кожных фибробластов на УФВ облучение не было столь велика, как в кератоцитах.


Рисунок 7. Влияние Деринат на УФB индуцированные повреждения кожи  у мышей линии BALB / C-nu.  (A) На кожу был нанесён гидрогель с Деринатом  или чистый гидрогель на 3 ч, а затем она облучена УФВ с Е = 360 мДж / см². Через семь дней, на представленных фотографиях животных, УФВ-индуцированное шелушение есть на коже спины, но отсутствует в области живота. Средняя панель показывает увеличенное  изображение спинных областей; (B) Деринат защищает кожу мышей линии BALB / C-nu от УФB-индуцированной эпидермальной пролиферации, повреждения ДНК и экспрессии циклооксигеназы (ЦОГ) -2. Нормальную кожу и УФB облученную, покрытую гидрогелем с  Деринатом или чистым гидрогелем окрашивали ДНЕ и H & E (гематоксилином и эозином), а оксидативное повреждение ДНК 8-oxodG анализировали с помощью иммуногистохимического анализа со специфическим анти-8-oxodG мышиными моноклональными антителами. Экспрессия ЦОГ-2 в эпидермисе была обнаружена  с помощью моноклональное антител к ЦОГ-2 кролика; ( С , D ), количественное определение внутриклеточной синтеза АФК и уровня ЦОГ-2 , ( B ) представленное  в указанной области включает в себя как эпидермис и дерму без сальных желез ( * , р <0,05; ** , р <0,01; ** * , р <0,001). Деринат снижал уровень УФВ-индуцированную экспрессию каналов класса TRPC7 ( E ) и повреждение ДНК 8-oxodG ( F ) у мышей линии BALB / C-nu на основе ОТ-ПЦР и ELISA - анализа, соответственно ( * , р <0,05; ** , р <0,01).

Как показано на рисунке 2 , после воздействия УФВ-облучения повышение внутриклеточного Са 2+  в кератоцитах в семь раз выше, чем в кожных фибробластах. Аналогичная тенденция была также продемонстрирована в соотношении синтеза АФК и повреждения ДНК. Различия между кератоцитами и кожными фибробластами может быть связано с различиями во внутриклеточном повышении Ca 2+  в связи с различным распределением каналов TRPCs в кератоцитах и кожных фибробластах при процессах УФВ-индуцированного повреждения в коже.

3. Экспериментальный раздел

3.1. Культуры клеток.

Человеческие первичные кератиноциты (КЦ) и человеческие фибробласты кожи (КФ) были выделены из операционного материала полученного при циркумцизии (с одобрения совета Комитета по биомедицинской этике / этике (IRB), номер KMUH-IRB-960119), как описано ранее [ 43 , 44 ]. Если коротко, то образцы крайней плоти промывали с помощью фосфатно-солевого буфера (PBS) (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и дезинфицировали 70%  спиртом. Материал измельчали ​​на мелкие кусочки. Чтобы изолировать КФ, небольшие кусочки дермы были погружены в раствор коллагеназы I типа  (3 мг / мл) (Sigma Chemicals Co .; Сент - Луис, штат Миссури, США) и тип IV коллагеназы IV типа  (3 мг / мл) (Sigma Chemicals Co .) при 37 С ° в течение 2 ч. Затем образцы инкубировали в 0,25% -ном растворе трипсина-ЭДТА (Gibco Invitrogen) при 37 ° С в течение 30 мин. Выделенные КФ выращивали в среде DMEM ,модифицированной Dilbecco  Eagle's medium DMEM (Gibco Invitrogen), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при 37 С °  в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% СО2 в  атмосфере. Чтобы изолировать КЦ, небольшие кусочки крайней плоти из образцов обрабатывали 1 ед / мл диспаза II (нейтральная протеаза) (Gibco  Invitrogen) при 4 C° в течение ночи. Эпидермис отделяли от крайней плоти образца и инкубировали в 0,25% растворе трипсина-ЭДТА при 37 °С в течение 15 мин. Выделенные КЦ культивировали в среде для кератиноцитов-SFM Eagle's medium (Gibco Invitrogen) при 37°С в увлажненном инкубаторе ,содержащем 5% СО2 в  атмосфере. Среду меняли каждые 3 дня.

 3.2. Анализ жизнеспособности клеток.

Клетки кожи, 2 × 10^5 КЦ или 1 × 10^5 КФ, были распространены на чашках диаметром 35 мм. Деринат (Technomedservis фармацевтическая компания, Мироновская, Россия) наносили после того, как клетки распространялись в посуде в течение 2 ч, а затем инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 . Клетки кожи были облучены Е = 50 мДж / см 2 для КЦ и Е = 100 мДж / см 2 для КФ лучами диапазона УФ-В  (источник УФ лучей 5 × 8 Вт, 312 нм; BLX-312, Vilber Lourmat, Франция) и заменяли нормальную среду для инкубирования каждые 24 ч. Соотношения выживших клеток кожи определяли с использованием 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2 Н - тетразолия (МТТ) (Sigma Aldrich, Сент - Луис, штат Миссури, США ) при 570 нм считывателем ELISA [ 45 ].

3.3. Визуализация кальция.

Внутриклеточные Ca 2+ ответы вызывались применением тапсигаргин (ТГ) (Sigma Aldrich), 1-олеоильная-2-ацетил-SN-глицерин (OAG) (Sigma Aldrich) и аденозинтрифосфат (АТФ) (Sigma Aldrich), в соответствии с описанными выше методами [ 44 ]. Перед экспериментами, клетки инкубировали с 1 мкМ Fluo-4-AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) при температуре 37 ° С в течение 20 мин , а затем промывали сбалансированным солевым раствором (ПБС) буфера (5,4 мМ КСl, 5,5 мМ d -глюкозы, 1 мМ MgSO 4 , 130 мМ NaCl, 20 мМ Hepes , рН 7,4, и 2 мМ CaCl 2 ). Концентрацию внутриклеточного Са 2+  рассчитывали по соотношению интенсивностей флуоресценции при возбуждении от  последовательных  3-х импульсов 488 нм света с разрешением 1376 × 1038 пикселей с использованием флуоресцентного микроскопа «Cell Olympus ^ R IX81» (Olympus, Токио, Япония) оборудован системой MT 20 освещения (Olympus) и UPLanApo 10 × линзы в объективе. Концентрация внутриклеточного Са 2+  была оценена на основании калибровочных кривых следующим образом: калибровочная кривая Ca 2+  была создана с использованием Ca 2+ калибровки буфера набора (Molecular Probes). Внутриклеточный Са 2+ ([Са 2+ ] I ) оценивали по Fluo-4 при стимуляции 488 нм и визуализировали с помощью клеточного флуоресцентного микроскопа «Olympus IX81 ^ R» и объектива UPLanApo 10 × при 20 ° C. Сигналы Fluo-4 были откалиброваны путем измерения интенсивности флуоресценции от микрокюветы, содержащей 10 мМ K2-EGTA (рН 7,20) забуференный к различным уровням[Са 2+ ]. Концентрацию Са 2+  анализировали с использованием следующей формулы: [Са2+ ] I = KD × (F - Fmin / Fmax - F). Графическое изображение интенсивности флуоресценции в сравнении с [Са 2+ ] получали из калибровочной кривой по формуле: [Ca 2+] I = KD × (F - Fmin / Fmax - F), где КД = 345 нм, F = интенсивность Fluo-4 , Fmax = 640, и Fmin = 21,7 для Fluo-4.

3.4. Иммунофлуоресценция.

Отношение степени повреждения ДНК к  маркеру 8-oxodG определяли с помощью анализа иммунофлуоресценции с использованием антител против 8-oxodG (Merck Millipore, Дармштадт, Германия). КЦ и КФ были обработаны растворами  с использованием Дерината или без него и культивировали на 24 мм покровные стекла 35 мм 6-луночных планшетах. Через 24 ч клетки облучали УФB-лучами с Е=50 мДж / см² и 100 мДж / см²  соответственно, а затем меняли нормальную среду для инкубирования через 24 ч. После трех промывок раствором PBS, клетки фиксировали путем инкубации с BD Cytofix в течение 10 мин. Фиксированные клетки затем кратковременно промывали ЗФР и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С в PBS, содержащем 5% сыворотки козьего и 1% бычьего сывороточного антигена с соответствующим образом разбавленного раствора моноклональных антител к 8-oxodG. После трех промывок PBS клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с Alexa 488-конъюгированный козьего IgM (Invitrogen) антимышиного IgM (Invitrogen) к 8-oxodG. Покровные стекла три раза промывали в PBS (5 мин каждый) и контрастном растворе 500 нг / мл 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, Sigma Aldrich) в течение 3 мин. Покровные стёкла  были смонтированы в слайды с применением противовыгорающего (при флуоресценции) монтажного раствора и показаны с помощью «Olympus FV1000» лазерного сканирующего микроскопа (Olympus).

 3.5. Анализ внутриклеточного синтеза активных форм кислорода в клетках кожи.

Эксперименты на животных  утверждены правилами использования животных по протоколу Университета Гаосюн IACUC номер официального утверждения: 101119. Мы сотрудничали с SOMAPEX Biotech&Cо. (Гаосюн, Тайвань) для разработки специального гидрогеля с Деринатом (Деринат-гидрогеля). Самцы  мышей линии BALB / C-nu  в возрасте 6 недель были приобретены в Национальной лаборатории и научно - исследовательском центре по разведению животных (Тайбэй, Тайвань). Были  по две мыши в каждой группе (три независимых эксперимента), которым был нанесён Деринат гидрогель или чистый гидрогель на 3 ч , а затем они были облучены УФВ с Е = 360 мДж / см². После семи дней эксперимента, небольшой участок ткани кожи, был вырезан из дорсальной области в мышей линии BALB / C-nu и окрашен с помощью 5 мкМ ДНЕ (краситель для окрашивания внутриклеточных АФК) в течение 30 мин. После окрашивания ткань кожи заливали 1,5% агаром низкой желатинизации, делали срезы 100 мкм микротомом DSK Microslicer (ДТК-1000, ТЭД ПЕЛЛА, INC., Реддинг, штат Калифорния, США), наносили  на предметные стекла и закрывали покровными стёклами. Внутриклеточная продукция АФК в клетках кожи визуализировалась с помощью лазерного сканирующего микроскопа «Olympus FV1000».

3.6. Иммуногистохимия ткани кожи.

В кратком изложении, участки кожи спины мышей линии BALB / C-nu  фиксировали и заливали в парафин. Моноклональное антитела к 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (8-oxodG) (Merck Millipore, 1: 200) [ 46 ] , и поликлональные антитела  к циклооксигеназе (ЦОГ) -2 (Abcam, Кембридж, Соединенное Королевство, 1: 500)  использовали , как описано ранее [ 6 ]. Иммунореактивность визуализировали путем инкубации с раствором субстрата ДАБ-хромогена (DAKO) в соответствии с протоколом производителя.

3.7. Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Общую РНК экстрагировали из участков кожи спины мышей линии BALB / C-nu с реагентом Trizol (Invitrogen).Для реакции с участием обратной транскриптазы  требуется на 1 мкг РНК синтезировать комплементарную ей ДНК с использованием набора RT (Invitrogen).Параметры инкубации устанавливали следующие: 10 мин при 25 °С, 120 мин при 37 °С и 5 минут при 85 ° C. Полученные кДНК были использованы для определения уровня экспрессии TRPC7 с помощью количественной ПЦР с использованием SybrGreen PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) и специфических праймеров: человеческий TRPC1 ( GenBank дополнительный номер NM_003304), прямая транскрипция: TAG TGA CGA НКУ ТСТ TGA CAA и обратная транскрипция: CTG GCA GTT AGA CTG GGA GA; человеческий TRPC4 (GenBank дополнительный номер, NM_003306), прямая транскрипция: CTC GCT ГГТ ACG ATG AGT TTC и обратная транскрипция: GTG GGC ТТТ TGG GAG СТА TCA; человек TRPC6 (дополнительный номер GenBank, NM_004621), прямая транскрипция: GTG ATC GCT CCA CAA НКУ ТАТ и обратная транскрипция: CTG CCA ACT GTA GGG CAT TCT; человек TRPC7 (дополнительный номер GenBank, NM_001167576), прямая транскрипция: CGA GAA ACA GCG GAA AGA CTC и обратная транскрипция: TCT GGC ТАА CTC GTT GCT GAG; человек GAPDH (GenBank , дополнительный номер, NM_ 002046), прямая транскрипция: ТГК ACC ACC AAC ТГК TTA GC и обратная транскрипция: GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG; мышь TRPC7 (GenBank , дополнительный номер, NM_012035), прямая транскрипция: AAC CTG ACA GCC AAT AGC ACC TTC и обратная транскрипция: TGG НКУ ТТС AGC ТАТ ACG КТК; мыши GAPDH (дополнительный номер Gene Bank, NM_001001303), прямая транскрипция: TGT GTC ВКТ ВКТ GGA TCT Г.А. и обратная транскрипция: ТТГ CTG TTG AAG TCG CAG GAG [ 47 ]. Термический цикл ПЦР выполнен на Applied Biosystems со скоростью 7900 в реальном масштабе времени с использованием следующих условий: 95 ° С в течение 10 мин, и 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с, и 60 ° С в течение 30 сек. Каждый полный этап амплификации с последующей стадией диссоциации при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 30 с.

3.8. Статистический анализ.

GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA) использовали для создания гистограмм; Столбики ошибок указывают на стандартные отклонения. Односторонний, двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) был также использован для сравнения средств каждой группы. Р - значение менее 0,05 для различий между группами считались статистически значимыми.

4. Выводы

Наши результаты показывают, что растворимый в воде дезоксирибонуклеат натрия (Деринат), защищает клетки кожи от УФ - индуцированного повреждения путем подавления TRPCs-активированного входа Ca 2+. Ингибирование внутриклеточного Ca 2+ также вносит значительный вклад в снижение уровня внутриклеточной продукции АФК митохондриями, что уменьшает повреждение ДНК в клетках кожи. Результаты экспериментов in vivo дополнительно подтверждают, что Деринат уменьшает внутриклеточный синтез АФК, экспрессию ЦОГ-2 и повреждение ДНК в клетках кожи мышей линии BALB / C-nu, подвергнутых воздействию УФ-B излучения в течение семи дней. Таким образом, Деринат снижает УФ-В-индуцированные повреждения и имеет большой потенциал для лечения ассоциированных с возрастом заболеваний или симптомов. Это соединение не даёт никаких очевидных побочных эффектов, что делает его применение пригодным для несметного количества разделов  здравоохранения и медицины.

Выражение признательности.

Мы благодарны Елене Корневой и покойного Елены Рыбакиной (Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург, Россия) за поставку Дерината. Мы также высоко ценим Научно-исследовательский центр ресурсов и развития медицинского университета  Гаосюн за доступ к использованию флуоресцентного микроскопа для конфокальной микроскопии «Olympus Cell ^ R IX81». Эта работа была поддержана  программой замедления старения "Цель для получения Грантов лучших университетов» (KMU-TP104G00, KMU-TP104G01 & KMU-TP104D04) медицинского университета  Гаосюн и Министерства науки и технологий Тайваня, MOST, 104- 2314-B-037-003 и 104-2314-B-037-060. Часть этих средств была выделена Glyen-Po Chen и Грантом  для научных исследований (KAKENHI) из Японского общества содействия развитию науки (JSPS), № 26506022.

Авторы исследования.

Тору Йошиока, Шиян-Чан Ян, Мами Нода и Вэнь-Ли Сю задумали и разработали исследование. Мин-Сянь Tsai выполнил статистический анализ. Синь-Су Ю, Вэнь-Ли Сю, Цзянь-он Лу и Jiadai Лю сделал экспериментальную работу, анализ данных и интерпретации результатов. Вэнь-Ли Хсу и Чинг-Ин Ву написали текст, а Манабу Сакакибара помогла с английским языком, терминами и отредактировала его. И, наконец, Мами Нода, Шиян-Чан Ян, Мин-Вэй Лин и Яв-Бин Хуан отредактировали окончательный вариант рукописи и, который сейчас представлен.

Конфликт интересов.

Авторы не заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература.

  1. Ахалая, MY;Максимова Г.В.;Рубин, AB;Lademann, J .;Darvin, ME молекулярные механизмы воздействия солнечной радиации и инфракрасного тепла на коже человека.Старение Res. Rev. 2014,16, 1-11.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  2. Джи, C .;Ян, Ю.Л.;Ян, Z .;Ту, Y .;Ченг, L .;Chen, B .;Ся, JP;Sun, WL;Су, ZL;Он, L .; идр.Perifosine сенсибилизирует UVB-индуцированных апоптоз в клетках кожи: Новый подтекст профилактики рака кожи?Cell. Сигнал. 2012,24, 1781-1789.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  3. Grether-Бек, S .;Felsner, я .;Koehler, Т .;Farwick, М .;Lersch, P .;Rawlings, AV;Krutmann, J. Актуальные керамиды ни усиления UVB-индуцированного апоптоза в нормальных человеческих кератиноцитов ине влияют нажизнеспособность в UVB-облучают реконструированных эпидермиса человека.Exp. Dermatol. 2014,23, 853-855.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  4. Kulms, D .;Шварц, Т. независимый вклад трех различных путей к ультрафиолетовому-B-индуцированные апоптозу.Biochem. Pharmacol. , 2002,64, 837-841.[Google Scholar] [CrossRef] 

  5. Darvin, ME;Gersonde, я .;Альбрехт, H .;Стерри, W .;Lademann, J.В естественных условияхкомбинационного спектроскопического анализа влияния УФ -излучения на каротиноидов антиоксидантной деградации вещества кожи человека.Методы лазерной Biol. Med. 2006,16, 833-837.[Google Scholar] [CrossRef] 

  6. Он, Ю.Д.;Лю, УТ;Лин, QX;Чжу, J .;Чжан, Y .;Ван, LY;Рен, XL;Е., XY Polydatin подавляет B-индуцированной экспрессии ультрафиолетовое циклооксигеназы-2в пробиркеив естественных условияхс помощью сокращения производства активных форм кислорода.Br. J. Dermatol. 2012,167, 941-944.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  7. Мукерджи, PK;Maity, N .;Нема, NK;Саркар, BK биоактивных соединений из природных ресурсов против старения кожи.Phytomed. Int. J. Phytother. Фитофарм. 2011,19, 64-73.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  8. Hwang, YP;Ким, HG;Хан, EH;Choi, JH;Парк, BH;Юнг, KH;Шин, YC;Jeong, HG N-ацетилглюкозамина подавляют активацию коллагеназы в ультрафиолетовых B-облученных фибробластов кожи человека:. Участие ионов кальция и митоген-активированной протеинкиназыJ.Dermatol. Sci. 2011,63, 93-103.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  9. Тиггес, J .;Хаарман-Stemmann, Т .;Vogel, CF;Гриндела, A .;Hubenthal, U .;Brenden, H .;Grether-Бек, S .;Vielhaber, G .;Johncock, W .;Krutmann, J .;др.Новый антагонист рецептора арилуглеводородномуЕ/Z-2-benzylindene-5,6-диметокси-3,3-диметилиндан-1-он защищает от UVB-индуцированная трансдукции сигнала.J. Investig. Dermatol. 2014,134, 556-559.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  10. Sviatkina, О.И.;Балашов, В.П.;Балыкова, LA;Щукин, SA Anti-аритмия активность Деринат в эксперименте.Эксп. Клин. Farmakol. 2004,67, 22-24.[Google Scholar] [PubMed] 

  11. Ван, Ю.Н.;Ву, W .;Чен, HC;Fang, H. генистеин защищает от UVB-индуцированных стареющих ,как характеристики в фибробласте человека кожном по p66Shc понижающего регулирования.J. Dermatol.Sci. 2010,58, 19-27.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  12. Громов, М.И.;Пивоварова, Л. П. Применение иммуномодулятора Деринат в лечении больных с хирургическим сепсисом при травматическом шоке.Вестн. Кир. Я. II Грек. 2002,161, 45-48.[Google Scholar] [PubMed] 

  13. Гура, NV;Bairakova, AL;Козлов, Л.В. Иммуноферментный анализ замаскированного компонента комплемента C4 недостаточности у больных с урогенитальной хламидийной инфекцией.Ж..Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2011,3, 76-80.[Google Scholar] [PubMed] 

  14. Земсков, AM;Земсков В.М.;Токмаков, А.И. Клиническая эффективность иммуностимулирующих препаратов при лечении гнойных инфекций.Khirurgiia 2011,2, 4-10.[Google Scholar] [PubMed] 

  15. Мангушев, AR;Рафаилов, В.В.;Сватко, LG Клиническая эффективность Деринат используется для лечения хронического аденоидит у детей.Вестн. Otorinolaringol. 2008,6, 33-34.[Google Scholar] [PubMed] 

  16. Земсков, AM;Киселев, А. В.;Ковешников, В.В. Иммунный статус больных с обострением хронических гнойных среднего отита и его коррекции.Вестн. Otorinolaringol. 2010,5, 38-40.[Google Scholar] [PubMed] 

  17. Leonavičienė, L .;Bernotienė, Е .;Bradūnaitė, R .;Vaitkienė, D .;Redaitienė, Е .;Астраускас, В. противоартритными и гепатопротекторное действие Деринат на адъювантной артрита у крыс.Acta Med. Litu. 2006,13, 236-244.[Google Scholar] 

  18. Паива, CN;Bozza, МТ ROS всегда вредно для патогенных микроорганизмов?Antioxid. Redox Signal.2013.[Google Scholar] [CrossRef] 

  19. Окаяма, Y. окислительный стресс при аллергических и воспалительных заболеваниях кожи.Curr.Drug Targets Inflamm. Allergy 2005,4, 517-519.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  20. Ханда, O .;Найто, Y .;Ёшикава, Т. хеликобактер пилори: A ROS индуцирующего видов бактерий в желудке.Inflamm. Местожительство Выкл. J. Eur. Гистамин Res. Soc. 2010,59, 997-1003.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  21. Masaki, H .;Izutsu, Y .;Yahagi, S .;Окано, Y. формы кислорода в НаСаТ кератиноцитов после УФВ облучения вызываются внутриклеточного Са (2+) уровнях.J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2009,14, 50-52.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  22. Цзян, SJ;Чу, AW;Лу, ZF;Pan, MH;Че, DF;Чжоу, XJ Ультрафиолетовое B-индуцированные изменения кожного барьера и эпидермального кальция градиента.Exp. Dermatol. 2007,16, 985-992.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  23. Хсу, WL;Йошиока, Т. Роль ГТО каналов в индукции белков теплового шока (БТШ) путем нагревания кожи.Биофизика 2015,11, 25-32.[Google Scholar] [CrossRef] 

  24. Венкатачалам, K .;Монтелл, C. TRP каналы.Ann. Rev. Biochem. 2007 , 76 , 387-417. [ Google Scholar ] [CrossRef ] [ PubMed ] 

  25. Пуннонен, K .;Yuspa, SH ультрафиолетовый свет облучения увеличивается клеточный диацилглицеринацилтрансферазы и индуцирует транслокацию диацилглицеринацилтрансферазы киназы в мышиных кератиноцитов.J. Investig. Dermatol. 1992,99, 221-226.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  26. Rae, MG;Hilton, J .;Шарки, антагонисты Дж ГТО Предполагаемые, SKF 96365, флуфенаминовая кислота и 2-АПБ, являются неконкурентные антагонисты рекомбинантного человеческого alpha1beta2gamma2 ГАМК (А) рецепторов.Neurochem. Int. 2012,60, 543-554.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  27. Дин, J .;Чжан, JR;Ван, Y .;Ли, CL;Lu, D .;Гуань, SM;Chen, J. Влияние неселективного TRPC канала блокатор, SKF-96365, на мелиттина-индуцированной спонтанной упорную ноцицепции и воспалительные гиперчувствительность боли.Neurosci. Bull. 2012,28, 173-181.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  28. Клэпхем, DE SnapShot:. Млекопитающим TRP каналыCell 2007.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  29. Фахардо, O .;Meseguer, V .;Бельмонте, C .;Виана, F. TRPA1 каналы: Новые целевые 1,4-дигидропиридинов.Каналы 2008,2, 429-438.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  30. Tiruppathi, C .;Ahmmed, GU;Vogel, SM;Малик, AB Ca2+сигнализации, TRP каналы и эндотелиальной проницаемости.Микроциркуляции 2006,13, 693-708.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  31. Ahmmed, GU;Малик, А. Б. Функциональная роль TRPC каналов в регуляции проницаемости эндотелия.Pflug. Архипелаг Евро. J. Physiol. 2005,451, 131-142.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  32. Nilius, В .;Owsianik, G .;Voets, Т .;Peters, JA Переходное рецепторов потенциальные каналы катиона в болезни.Physiol. Rev. 2007,87, 165-217.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  33. Яо, X .;Garland, CJ Последние разработки в областисосудистых эндотелиальных клеток переходных потенциальных каналов рецепторов.Circ. Res. , 2005,97, 853-863.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  34. Toth, BI;Олах, A .;Сёллёши, AG;Биро, Т. TRP каналов в коже.Br. J. Pharmacol. 2014 , 171 , 2568-2581. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] 

  35. Vandael, DH;Оттавиани, MM;Легро, C .;Лефорт, C .;Guerineau, NC;Allio, A .;Карабелли, V .;Карбон, E. Пониженный наличие напряжения натриевых каналов путем деполяризации или блокады состороны тетродотоксин повышений взрыв стрельбы и высвобождение катехоламинов в мышиных клетках хромафинных.J. Physiol. 2015,593, 905-927.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  36. Morley, N .;Керноу, A .;Salter, L .;Кэмпбелл, S .;Гулд, D.N-acetyl-л-цистеин предотвращает повреждение ДНК ,вызванное UVA, UVB и видимым излучением в человеческих фибробластов.J.Photochem. Photobiol. В Biol. 2003,72, 55-60.[Google Scholar] [CrossRef] 

  37. Оикава, S. Последовательность специфических повреждений ДНК спомощью активных форм кислорода: последствия для канцерогенеза и старения.Environ. Здоровье Пред. Med. 2005,10, 65-71.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  38. Розен, JE;Prahalad, АК;Williams, формирование ГМ 8-Oxodeoxyguanosine в ДНК культивируемых клеток после воздействия H2O2в одиночку или с УФВ или УФА облучения.PHOTOCHEM.Photobiol. 1996,64, 117-122.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  39. Ван, Южная Каролина;Чен, BH;Ван, LF;Чен, JS Характеристика хондроитина сульфата и его сети гидрогели взаимопроникающие полимерные для высвобождения лекарственного средства сзамедленным.Int. J. Pharm. 2007,329, 103-109.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  40. Mi, FL;Лян, HF;Ву, YC;Лин, Ю.С.;Ян, TF;Sung, HW рН-чувствительных поведение двухкомпонентных гидрогели ,состоящих изN,O-карбоксиметил хитозан и альгинат.J. Biomater.Sci. Polym. Под ред. 2005 , 16 , 1333-1345. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] 

  41. Атар, М .; , КП; Морель, KD; Ким, AL; Aszterbaum, М .; Лонгли, J .; Эпштейн, EH, Jr .; Бикерс, DR Ультрафиолетовое B (UVB) индуцированная экспрессия ЦОГ-2 в мышиной кожи:. Иммуногистохимическое исследование Biochem. Biophys. Местожительство Commun. , 2001 , 280 , 1042-1047. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] 

  42. Ван, JY;Чен, БК;Ван, Ю.С.;Tsai, УТ;Чен, туалет;Чанг, туалет;Hou, MF;Ву, YC;Чанг, туалет Участие в магазине работает кальциевой сигнализации в ЭФР-опосредованной ЦОГ-2 активации генов в раковых клетках.Cell. Сигнал. 2012,24, 162-169.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  43. Ляо, WT;Ю., HS;Arbiser, JL;Hong, CH;Говиндараджан, В .;Chai, CY;Шаня, WJ;Лин, YF;Чен, GS;Lee, CH Enhanced релиз МСР-1 по келоидных CD14 + клеток увеличивает пролиферацию фибробластов: Роль MCP-1 и Akt пути в келоидных.Exp. Dermatol. 2010,19, E142-E150.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  44. Хсу, WL;Tsai, MH;Лин, МВт;Чиу, YC;Лу, JH;Чанг, CH;Ю., HS;Йошиока, Т. Дифференциальные эффекты мышьяка на кальциевой сигнализации в первичных кератиноцитов и злокачественных (HSC-1) клеток.Cell Calcium 2012,52, 161-169.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  45. Хсу, WL;Chung, PJ;Tsai, MH;Чанг, CL;Лян, CL роль для Эпштейна-Барр вирусной BALF1 в содействии формированию опухоли и метастаз потенциал.Вирус Res. 2012,163, 617-627.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  46. Фуджита, K .;Seike, Т .;Yutsudo, N .;Ohno, M .;Ямада, H .;Yamaguchi, H .;Sakumi, K .;Ямакава, Y .;Kido, MA;Takaki, A .; идр.Водород в питьевой воде снижает дофаминергические потерю нейронов в мышиной модели 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина болезни Паркинсона.PLoS ONE2009,4, e7247.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed] 

  47. Чхон, ГДж;Кюи, Y .;Ен, DS;Kwon, SC;Парк, BG Механизмы изменения подвижности на тринитробензолсульфоновой кислотно-индуцированного воспаления толстого кишечника у мышей.Корейский J. Physiol. Pharmacol. 2012,16, 437-446.[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]